Blood DNA Kit细菌DNA提取试剂盒（柱提型）

使用说明书

【产品名称】

通用名称：Blood DNA Kit细菌DNA提取试剂盒（柱提型）

商品名称：Blood DNA Kit细菌DNA提取试剂盒（柱提型）

型号：ZT-005
【预期用途】

    本试剂盒采用可以特异性结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取样品中的核酸。离心吸附柱中采用的硅基质材料可高效、专一吸附核酸，结合独特的缓冲液系统可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的核酸片段完整，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒纯化的核酸适用于酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等各种常规实验，和芯片杂交、高通量测序等高质量核酸需求的实验。本产品预期是由专业人员使用，如经过分子生物学技术培训的技术人员和医生。

 【检验原理】

     1.样本适用广泛：可从大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，来自于鼻咽拭子的百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis），来自于脑脊液的博氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi），来自于肺泡灌洗 液的嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）等细菌及革兰氏阳性菌中提取DNA。

2.高质量：独特的裂解缓冲体系，纯化的DNA具有高浓度，高纯度，完整性好等特点，满足芯片杂交，高通量测序等实验需求。

3.快速无毒：采用采用硅胶膜吸附原理，无需酚氯仿。

注意事项（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项）：

1．样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小、提取量下降。

2．若裂解液1，裂解液3中有沉淀，可在70℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。

3．样本及洗脱液3平衡至室温。

4．所有离心步骤均为室温下离心。

 【主要组成成份】

客户需自行准备物品包括：96~100%乙醇、RNase A（100 mg/ml）、对于拭子样本：含普通杀菌剂的PBS、对于革兰氏阳性菌和难以裂解的细菌：20 mg/ml的溶菌酶或200 μg/ml的溶葡球菌酶lysostaphin（溶于20 mM Tris·HCl, pH 8.0; 2 mM EDTA; 1.2% Triton X-100中）、带滤芯枪头、可加热至58°C/95°C且可混匀的金属浴、离心机（可放入1.5ml和2ml离心管）、旋涡振荡仪。

 【储存条件及有效期】

该试剂盒置于室温（15~25℃）干燥条件下，可保存12个月。如果室温超过25℃，吸附柱1和蛋白酶可置于2~8℃保存。

 【试剂准备】

使用前先在洗液3和洗液4中加入96~100%乙醇，洗液3瓶中加入17ml 96~100%乙醇；洗液4瓶中加入21ml 96~100%乙醇。蛋白酶瓶中加入1.5ml蛋白酶溶解液溶解（溶解后的蛋白酶至于2~8℃保存）。

 【样本准备】

1.生物流体中的细菌DNA：5000g离心10分钟，将沉淀重悬在180 μl裂解液1。然后按核酸提取步骤提取。

2.从眼、鼻、咽或其他拭子中分离细菌DNA：收集样品，放入含有普通杀真菌剂的2毫升PBS中，在室温（15~25摄氏度）孵育数小时；5000g离心10分钟，将沉淀重悬在180 μl裂解液1。然后按核酸提取步骤提取。

3.从生长在培养皿培养基上的细菌培养物提取细菌DNA：用接种环取出培养基中的细菌，通过剧烈搅拌的方式重悬在180 μl裂解液1中。然后按核酸提取步骤提取。

4.提取液体培养基中的细菌DNA：取1ml液体培养基5000g离心5分钟，将沉淀重悬在180 μl裂解液1。然后按核酸提取步骤提取。

5.提取革兰氏阳性菌DNA：5000g离心10分钟，然后吸弃上清，留下细菌沉淀；将细菌沉淀重悬在180µl酶溶液中，37°C温浴至少30分钟；加入25μl蛋白酶和200μl裂解液3，混匀后58 °C温浴30分钟和95 °C温浴15分钟；按核酸提取步骤5步开始提取。

注意：酶溶液可以是20 mg/ml的溶菌酶，也可以是200 μg/ml的溶葡球菌酶lysostaphin（溶于20 mM Tris·HCl, pH 8.0; 2 mM EDTA; 1.2% Triton X-100中）。

 【操作步骤】

1.加25μl蛋白酶，涡旋振荡10秒。

2.放在可漩涡振荡的温浴器上58℃温浴并振荡混匀至彻底裂解（一般1-3小时，可过夜）。如果用无法振荡混匀的干浴锅或水浴锅，则每15分钟混匀一次。

3.瞬时离心，加入4μl RNase A（100 mg/ml）室温（15~25℃）温浴2分钟；若不需去除RNA，此步不用做直接跳至下一步。

4.瞬时离心，加入200 μl裂解液3，充分混匀70℃温浴10分钟。

5.瞬时离心，加入200 μl乙醇（96~100%），盖上盖子，涡旋振荡混合15秒。

注意：如果室温超过25°C，在冰上冷却乙醇，再加入到管中。

6.瞬时离心，加入吸附柱中，6000g以上的速度离心1分钟，将吸附柱放置在干净的2 ml收集管中，弃去含有流出液的收集管。

注意：6000g离心只是会降低噪音，以更高速度离心不影响DNA提取。

7.加入500μl洗液3（以加乙醇）6000g的速度离心1分钟，将吸附柱放置在干净的2 ml收集管中，弃去含有流出液的收集管。

8.加入500μl洗液4（以加乙醇）20000g的速度离心3分钟，将吸附柱放置在干净的2 ml收集管中，弃去含有流出液的收集管。

9.建议步骤：20000g的速度离心1分钟。

10.换新离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加200μl洗脱液3，室温温浴1分钟，6000g的速度离心1分钟。

11.生物流体中的细菌DNA：5000g离心10分钟，将沉淀重悬在180 μl裂解液1。然后按核酸提取步骤提取。

12.从眼、鼻、咽或其他拭子中分离细菌DNA：收集样品，放入含有普通杀真菌剂的2毫升PBS中，在室温（15~25摄氏度）孵育数小时；5000g离心10分钟，将沉淀重悬在180 μl裂解液1。然后按核酸提取步骤提取。

13.从生长在培养皿培养基上的细菌培养物提取细菌DNA：用接种环取出培养基中的细菌，通过剧烈搅拌的方式重悬在180 μl裂解液1中。然后按核酸提取步骤提取。

14.提取液体培养基中的细菌DNA：取1ml液体培养基5000g离心5分钟，将沉淀重悬在180 μl裂解液1。然后按核酸提取步骤提取。

15.提取革兰氏阳性菌DNA：5000g离心10分钟，然后吸弃上清，留下细菌沉淀；将细菌沉淀重悬在180µl酶溶液中，37°C温浴至少30分钟；加入25μl蛋白酶和200μl裂解液3，混匀后58 °C温浴30分钟和95 °C温浴15分钟；按核酸提取步骤5步开始提取。

注意：酶溶液可以是20 mg/ml的溶菌酶，也可以是200 μg/ml的溶葡球菌酶lysostaphin（溶于20 mM Tris·HCl, pH 8.0; 2 mM EDTA; 1.2% Triton X-100中）。