Blood DNA KitFFPE组织DNA提取试剂盒（柱提型）

使用说明书

【产品名称】

通用名称：Blood DNA KitFFPE组织DNA提取试剂盒（柱提型）

商品名称：Blood DNA KitFFPE组织DNA提取试剂盒（柱提型）
 型号：ZT-006

【预期用途】

本试剂盒采用可以特异性结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取组织样品中的核酸。离心吸附柱中采用的硅基质材料可高效、专一吸附核酸，结合独特的缓冲液系统可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的核酸片段完整，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒纯化的核酸适用于酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等各种常规实验，和芯片杂交、高通量测序等高质量核酸需求的实验。本产品预期是由专业人员使用，如经过分子生物学技术培训的技术人员和医生。
  

【检验原理】

可从组织中直接提取DNA（包括基因组DNA，线粒体DNA），样本可以是福尔马林固定或石蜡包埋。独特的裂解缓冲体系，纯化的DNA具有高浓度，高纯度，完整性好等特点，满足芯片杂交，高通量测序等实验需求。采用采用硅胶膜吸附原理，无需酚氯仿。
  

【主要组成成份】

 

客户需自行准备物品包括：96～100%乙醇、RNase A（100 mg/ml）、PBS、二甲苯、带滤芯枪头、可加热至58°C/90°C/70℃且可混匀的金属浴、离心机（可放入1.5ml和2ml离心管）、旋涡振荡仪。
  

【储存条件及有效期】

该试剂盒置于室温（15~25℃）干燥条件下，可保存12个月。如果室温超过25℃，吸附柱1和蛋白酶可置于2~8℃保存。
  

【试剂准备】

使用前先在洗液3和洗液4中加入96~100%乙醇，洗液3瓶中加入17ml 96~100%乙醇；洗液4瓶中加入21ml 96~100%乙醇。蛋白酶瓶中加入1.5ml蛋白酶溶解液溶解（溶解后的蛋白酶至于2~8℃保存）。
  

【样本要求】
  

提取FFPE组织DNA（包括基因组DNA和线粒体DNA）

样本应使用福尔马林固定和石蜡包埋标准步骤。为限制DNA断裂程度，需保证：

1．手术切除后尽快用4~10%福尔马林固定组织样品

2．采用的固定时间为14~24小时（固定时间较长导致更严重的DNA断裂，导致下游分析中性能较差）。

3．样品包埋前需彻底脱水（残留福尔马林可以抑制蛋白酶K的消化）。

4．用于DNA纯化的原料应为新鲜的FFPE组织切片，一次制备中切片应同时满足切片数量不超过8个、每片厚度不超过10μm且表面积不超过250 mm2三个条件。若您无原料性质的相关信息，我们建议每次制备开始不超过3个切片，根据DNA产率和纯度，在后续制备中可能使用多达8个切片。

 石蜡包埋组织样本前处理：

1．使用手术刀，修剪样品块中多余的石蜡。

2．切不超过4个切片，厚度10μm；或切不超过8个切片，厚度5μm。如果样品表面已暴露于空气，则丢弃最先2~3个切片。立即将各切片置于1.5或2 ml微量离心管中（未提供）。

3．在样品中加入1 ml二甲苯。合盖并剧烈涡旋10秒。室温（15~25℃）下全速离心2分钟。去除上清液。不能去除任何沉淀。

4．在沉淀中加入1 ml乙醇（96~100%）然后涡旋混匀。乙醇提取样品中的残留二甲苯。室温（15~25℃）下全速离心2分钟。去除上清液。不能去除任何沉淀。使用较细的移液器吸头小心移去任何残留乙醇。

 注意:若有必要此步可重复一次。

５．打开该管并在不超过37℃的温度下孵育10分钟或直到所有残留乙醇挥发干。

６．加入180μl裂解液1中重悬沉淀。加入25 μl蛋白酶，涡旋混匀。

            ７．在58℃孵育消化1-3小时或至样本消化完全（大多数情况1小时内可彻底溶解，有时候可能需要过夜）。建议消化时样本放于摇床等仪器上保持不间断的混匀。然后按以下核酸提取步骤提取核酸。

福尔马林固定组织样本前处理：

1．切不超过25mg组织或10mg脾脏组织用PBS洗涤样本2次，用于除去固定剂。

 

2．从以下三种方法中选择一种处理样本（b,c这2种方法样本裂解时间会少于a）：a.将组织切成小块，加入220μl裂解液1; b.将组织放入液氮中，并用研钵和杵彻底研磨。然后将组织粉末和液氮倒入1.5毫升微量离心管。让液氮蒸发（但不允许解冻组织），并加入220μl裂解液1；c.将组织和80μl PBS加入匀浆器匀浆，组织匀浆后加入140μl裂解液1。

3．加入25 μl蛋白酶，涡旋混匀，在58℃孵育消化1-3小时或至样本消化完全。建议消化时样本放于摇床等仪器上保持不间断的混匀。

4．然后按以下核酸提取步骤提取核酸。

 

【注意事项】（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项）：

1．样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小、提取量下降。

2．若裂解液1，裂解液3中有沉淀，可在70℃水浴中重新溶解，摇匀后使用。

3．RNA会抑制一些下游酶反应，但不会抑制PCR，如需去除RNA残留，需自备RNase A（100 mg/ml）溶液。

4．样本及所有缓冲液平衡至室温。

 【操作步骤】

1．瞬时离心，加入4μl RNase A（100 mg/ml）混匀室温（15~25℃）温浴2分钟；若不需去除RNA，此步不用做直接跳至下一步。

2．90℃孵育消化1小时，瞬时离心，加入200 μl裂解液3，充分混匀。

3．瞬时离心，加入200 μl乙醇（96~100%），盖上盖子，涡旋振荡混合15秒。

注意：如果室温超过25°C，在冰上冷却乙醇，再加入到管中。

4．瞬时离心，加入吸附柱中，6000g以上的速度离心1分钟，将吸附柱放置在干净的2 ml收集管中，弃去含有流出液的收集管。

注意：6000g离心只是会降低噪音，以更高速度离心不影响DNA提取。

５．加入500μl洗液3（以加乙醇）6000g的速度离心1分钟，将吸附柱放置在干净的2 ml收集管中，弃去含有流出液的收集管。

６．加入500μl洗液4（以加乙醇）6000g的速度离心1分钟，将吸附柱放置在干净的2 ml收集管中，弃去含有流出液的收集管。

７．20000g的速度离心3分钟。

８．换新离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加50μl -200μl洗脱液3，室温温浴5分钟，20000g的速度离心1分钟。